フローサイトメトリー解析

産業医科大学第1内科学講座
　久保 智史

そもそもフローサイトメトリーって何？

簡単に言うと、フローサイトメトリー（Flow Cytometry）は機器の中に調べたい細胞を1列で流し、レーザーを当ててその性質を測定する技術です。測定できる性質として、細胞の大きさ、細胞の複雑さ（内部構造）、そして特定のタンパク質の細胞表面や細胞内における量を定量的に測定することができます。中でもタンパク質の定量的測定が最も重要な機能です。特に、細胞１つ１つのタンパク質発現量を見ることができるので、組織や末梢血における特定の細胞集団の割合を検出するのに優れています。

何ができる？

フローサイトメトリーは抗体を用いてタンパク質を測定します。特に、細胞表面にある「CDマーカー（CD3, CD4, CD19など）」と呼ばれる名札のようなタンパク質を検出することで、T細胞やB細胞といった細胞の種類を特定できます。これが１つ１つの細胞で検出できるため、流した細胞の中で何割がT細胞なのか、何割がB細胞なのか、といった構成比率がわかります。さらに、CD25やFoxp3など抗体を用いることで制御性T細胞などの更に詳細なサブセットも検出することができます。一方で、抗体を用いて測定する原理上、特徴的な細胞表面抗原がわかっていない未知の細胞集団の特定はできません。

リウマチ学で使われるフローサイトメトリー解析

基礎研究ではフローサイトメトリーは汎用されています。例えばT細胞を試験管内で刺激したときに出てくる分子を検出して、どのようなサイトカイン環境下だと刺激が増強されるか、といった変化も簡単に検出することができます。別項のトランスクリプトーム解析（RNA-seq）に比べると網羅性は大きく落ちますが、タンパク質を直接測定できること、簡便であること、安価であることが大きな利点です。
また、自己免疫疾患では、末梢血や組織の免疫細胞の割合変化が見られることがわかっています（下図）。その免疫細胞の割合変化（免疫フェノタイプ）を検出するためにフローサイトメトリーは最も基本的かつ重要なツールです。最近は数十種類の抗原を同時に見るマルチカラーフローサイトメトリー解析の登場により、詳細に細胞の割合を検出できるようになりました。

フローサイトメトリー解析の結果の見方について

フローサイトメトリーの図は、単純に棒グラフなどで割合を示す場合と、ドットプロット（Dot plot）と呼ばれる特有の図で示される場合があります。ここでは論文で使用されることの多い基本的なドットプロットについて解説します。
フローサイトメトリーの解析は、流した数万個の細胞の中から目的の細胞集団を囲って選び出すゲーティングという作業を行います。その際に使用されるのがドットプロットで、論文でもそのまま使用されます。ドットプロットは2つのマーカーをX軸とY軸にとり、細胞1つ1つを点としてプロットした図です。 例えば、X軸を、CXCR3、Y軸をCCR6とした場合、図は田の字型の4つの領域（分画）に分かれます（右図）。すると右上は両方持っている細胞、右下はCXCR3だけ持っている細胞（Th1細胞に該当）、左上はCCR6だけ持っている細胞（Th17細胞に該当）、左下が両方持っていない細胞を意味します。このように、対象とするマーカー陽性の細胞が「全体の何％存在するか」を数字で出し、患者群と健常群などで比較を行います。さらに、この図からCXCR3陽性細胞（右下）の中でどれくらいの割合がCD69陽性か、ということもゲーティングを続けることで詳細な解析が可能となります。

まとめ

フローサイトメトリーは、細胞1つ1つのタンパク質発現量をレーザーにより定量的に測定する技術であり、リウマチ学において免疫細胞の種類や割合（免疫フェノタイプ）を解析するための最も基本的かつ重要なツールです。論文のデータを読み解く際は、ドットプロットのX軸・Y軸が何を指しているかを確認し、どの分画の細胞が増減しているかに注目することが重要です。